Chế độ phân tách và cột trong HPLC
Thuật ngữ: tế bào dòng chảy = Flow cell = Cell đo mẫu, Detector = Đầu dò; Chất nhồi = Pha tĩnh; Bộ tiêm mẫu = Injector; Bộ tiêm mẫu tự động = Auto Sampler
Mỗi người đều có sở thích riêng của mình. Tuy nhiên, trong thế giới vật chất, các chất giống nhau hơn có mối quan hệ chặt chẽ hơn với nhau và mong muốn tồn tại cùng nhau. Hãy quan sát những gì xảy ra trong một cột.
Khi vào cột, mẫu được phân phối bởi chất rửa giải trước tiên sẽ được chất nhồi (pha tĩnh) trong cột giữ lại. Mức độ giữ lại từng thành phần của mẫu phụ thuộc vào các đặc tính của nó. Một thành phần có các đặc tính khác với các đặc tính của pha tĩnh sẽ hòa tan trước đó vào chất rửa giải để di chuyển trong cột. Trong khi đó, thành phần có ái lực cao hơn với pha tĩnh được giữ lại trong thời gian dài hơn, do đó di chuyển chậm hơn trong cột. Do đó, tốc độ mà mỗi thành phần di chuyển trong cột phụ thuộc vào việc thành phần thích (có tính chất tương tự như) pha tĩnh hay chất rửa giải.
Các phương pháp phân tách được phân loại thành bốn chế độ: hấp phụ, phân vùng, trao đổi ion và loại trừ kích thước. Trên thực tế, một số chế độ này dường như gây ra sự tách biệt khi kết hợp. Tuy nhiên, gần đây, người ta đã chú ý đến một chế độ phân tách khác dựa trên tương tác ưa nước, được gọi là HILIC. Ở đây, từng chế độ tách sẽ được giải thích.
Chế độ hấp phụ
Đầu lịch sử của sắc ký, silica gel hoặc alumin đã được sử dụng như một pha tĩnh để tách các chất có thể được hấp phụ trực tiếp trên bề mặt của pha tĩnh. Do tính chọn lọc cao nên cột silica gel vẫn được sử dụng để tách các đồng phân,… Tuy nhiên, loại chất này có nhược điểm là hư hỏng sớm và khả năng tái tạo kém. Hiện tượng hấp phụ được sử dụng trong chất khử mùi, vv vì có đặc tính là các chất bị giữ lại rất khó loại bỏ.
Do đó, nhiều thành phần bị hấp phụ vẫn không bị phân hủy, điều này làm giảm số lượng vị trí hấp phụ, dẫn đến tốc độ rửa giải dần dần.
Chế độ này không gây khó khăn trong các phép phân tích trong đó một cột được sử dụng một lần hoặc hai lần để chưng cất phân đoạn, chẳng hạn như trong sắc ký cột. Tuy nhiên, chế độ này không phù hợp lắm với các phép phân tích trong đó một cột được sử dụng nhiều lần để xử lý nhiều mẫu, như trong HPLC ngày nay. Do đó, chế độ phân vùng được tạo ra như một phương pháp phân tách khác.
Chế độ phân bố
Thuật ngữ “ODS” hoặc “C18” và thuật ngữ “pha đảo ” hoặc “phân bố” thường được nghe là tên của một cột và phương pháp tách, tương ứng. Tất cả các thuật ngữ này chỉ ra chế độ phân tách giống hệt nhau. Là chất nhồi trong hệ thống phân vùng, silica gel liên kết hóa học bởi ODS (Octadesylsilane, là một hợp chất có chứa chuỗi 18 nguyên tử cacbon, thể hiện tính chất nhờn) thường được sử dụng để bù đắp nhược điểm của chế độ hấp phụ. So với silica gel truyền thống, chất làm pha tĩnh này ổn định khi sử dụng, vì một phần của bề mặt silica gel của nó được liên kết bởi ODS và phần hấp phụ khác của bề mặt cũng được xử lý. Có thể nói, sự phát triển của pha tĩnh này đã tạo ra sự tiến bộ của sắc ký cho HPLC ngày nay.
Chất làm đầy có thể được coi là một loại gel silica phủ ODS. Mẫu được phân tách giữa pha ODS và pha rửa giải. Để hiểu tình huống này, hình ảnh một sự phân tách được trình bày
Giấm và dầu salad lần lượt có hai lớp nước và dầu. Khi lắc mạnh, hai chất này sẽ được trộn lẫn. Tuy nhiên, nếu để một thời gian, hai chất này sẽ lại tách ra, vì chúng vốn là “nước và dầu” không tương thích với nhau.
Một mẫu được thêm vào dung dịch trong điều kiện như vậy được chia thành các thành phần tan trong nước và tan trong dầu theo tính chất của chúng giữa hai pha. Các thành phần dễ hòa tan hơn trong dung dịch rửa giải được rửa giải sớm hơn khỏi cột.
Có nhiều pha tĩnh khác được xử lý hóa học, C8 (octyl, -C8H17), Ph (phenyl, -C6H5), -CN (cyano), -NH2 (amino) và Diol, và mỗi pha tĩnh có các đặc tính phân tách khác nhau. Mặc dù nói chung, chất làm pha tĩnh ODS nên được chọn trước tiên và nếu pha tĩnh ODS không hoạt động thành công, có thể kiểm tra pha tĩnh khác.
“Reverse phase” có thể được đặt trước cho chế độ phân bố. Điều này là do chế độ phân vùng có mối quan hệ ngược lại giữa pha động và pha tĩnh, trái ngược với chế độ hấp phụ truyền thống.
Cột ODS cung cấp hiệu suất có giống nhau không?Hầu hết các nhà sản xuất cột tiếp thị cột ODS. Tuy nhiên, các cột ODS này có các đặc điểm khác nhau và có thể thực hiện các phân tách rất khác nhau, mặc dù sử dụng cùng một chất rửa giải. Các đặc tính của cột ODS phụ thuộc vào đặc tính của silica gel (kích thước hạt, đường kính lỗ, v.v.), phương pháp liên kết ODS, lượng ODS liên kết và xử lý bề mặt.
|
Việc sử dụng thuật ngữ, “cực” có thể gây khó khăn cho việc hình thành khái niệm. Các chất “phân cực cao” và “phân cực thấp” tương ứng có thể được coi là nước và dầu. Do đó, sự khác biệt giữa hai chế độ có thể được hiển thị như sau:
Chế độ hấp phụ: chất rửa giải “dầu” (hexan, octan, v.v.) chảy trên pha tĩnh ” watery”. Chế độ phân vùng: chất rửa giải “watery” (metanol, axetonitril, nước, v.v.) chảy trên pha tĩnh “dầu”.
Khi cùng một mẫu được phân tách theo từng chế độ này, các thành phần được rửa giải theo thứ tự ngược lại. Do đó, sự kết hợp của “chất nhồi cột có độ phân cực cao và chất rửa giải phân cực thấp” trong chế độ hấp phụ truyền thống và của “chất nhồi cột phân cực thấp và chất rửa giải có độ phân cực cao” trong chế độ phân vùng được gọi là pha bình thường và pha ngược, tương ứng.
Chế độ trao đổi ion
Các chất ion, bao gồm axit amin và ion vô cơ đi qua cột ODS mà không bị ODS phân tách. Những chất này có thể được tách ra bằng một loại nhựa trao đổi ion. Các ion âm như ion clorua (Cl-) và sunfua (SO42-), và các ion dương như Na + và Ca2 + lần lượt được tách ra bằng nhựa trao đổi anion- và cation. Mặc dù có cả nhóm -NH2 (amino, cation) và -COOH (cacboxyl, anion), các axit amin có thể được tách bằng nhựa trao đổi cation bằng cách sử dụng chất rửa giải có tính axit để ngăn chặn sự phân ly của -COOH. Tốc độ mà một thành phần di chuyển trong cột trao đổi ion phụ thuộc vào xu hướng trở thành ion và xu hướng liên kết với nhựa trao đổi ion để ổn định.
Chế độ loại trừ kích thước
Các thành phần cao phân tử như nhựa tổng hợp và protein có thể được phân tách theo kích thước của chúng, với các chất nhồi cột giống như rây. Chất nhồi có hình cầu và chứa nhiều lỗ giống như lưới. Các phân tử nhỏ có thể đi qua chất nhồi qua các lỗ này, nhưng dành nhiều thời gian để chạy qua mê cung trong chất nhồi. Trong khi đó, các phân tử lớn không thể đi vào các lỗ sẽ di chuyển giữa các chất nhồi, đến đầu ra của cột sớm hơn.
Các phân tử đủ nhỏ để đi vào khoang dành thời gian khác nhau để đi qua cột, tùy theo kích thước của chúng.
Sau khi đo một mẫu chuẩn với khối lượng phân tử đã biết, có thể lập đường chuẩn, trong đó trục tung biểu thị khối lượng phân tử logarit và trục hoành biểu thị thời gian rửa giải (thể tích). Sử dụng đường cong này, có thể xác định sự phân bố khối lượng phân tử và khối lượng phân tử trung bình của một mẫu chưa biết.
Chế độ tách này được gọi là loại trừ kích thước (SEC: Size Exclusive Chromatography) hoặc thấm qua gel (GPC: Gel Permeation Chromatography). Không giống như phân tách các thành phần có trọng lượng phân tử thấp, SEC / GPC phân tách các phân tử theo kích thước của chúng. Do đó, rất khó để tách nhiều hỗn hợp polyme có kích thước phân tử tương tự nhau.
Chế độ HILIC
HILIC là viết tắt của Hydrophilic Interaction Chromatography, và là một chế độ phân tách dựa trên tương tác ưa nước. Chế độ ODS sử dụng chất nhồi phân cực thấp để tách, dựa trên tương tác kỵ nước. Chế độ HILIC sử dụng silica gel hoặc chất phân cực cao có các nhóm phân cực làm chất nhồi để tách.
Nếu ODS được coi là chế độ phân vùng ngược pha thì HILIC có thể được coi là chế độ phân vùng pha bình thường. Đối với chế độ ODS, các thành phần hòa tan trong nước được rửa giải sớm hơn, đôi khi dẫn đến sự phân tách không đủ. Sự phân tách như vậy có thể được cải thiện trong chế độ HILIC, vì các thành phần hòa tan trong nước được rửa giải sau đó. Để trì hoãn quá trình rửa giải, hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước được sử dụng làm chất rửa giải với tỷ lệ dung môi hữu cơ cao.
Ví dụ, phân tích đường với cột NH2 được thực hiện bằng chế độ HILIC. Chế độ này có lợi thế đặc biệt đối với sự phân tách
