Nguyên lý và cấu hình hệ thống của HPLC

Bộ phận bơm

Cần thiết phải thực hiện bơm chất rửa giải với tốc độ dòng chảy và áp suất không đổi.
Máy bơm HPLC phân tích, thông thường là loại phổ biến nhất, nhưng máy bơm bán vi mô (semi-micro) và máy bơm điều chế cũng được sử dụng tùy thuộc vào phạm vi của tốc độ dòng dung dịch rửa giải yêu cầu.

Máy bơm được lựa chọn để phù hợp với mục đích phân tích.

Các phép phân tích lần đầu tiên được thực hiện bằng cách sử dụng phép phân tách đẳng dòng (Isocratic) trong đó thành phần dung dịch rửa giải không thay đổi trong quá trình phân tích. Kỹ thuật này thích hợp cho các phân tách đơn giản. Khi một mẫu chứa nhiều thành phần, chẳng hạn như mẫu để phân tích axit amin được phân tích, rất khó để tách tất cả các thành phần một cách hiệu quả chỉ sử dụng một chất rửa giải.
Phân tích gradient cho phép thay đổi thành phần của dung dịch rửa giải trong quá trình phân tích. Điều này thường chỉ ra rằng gradient nồng độ được tạo ra theo cách tuyến tính. Tuy nhiên, nếu thành phần dung dịch rửa giải được thay đổi theo từng bước, thì đây được gọi là các bước gradient.

Hình 2 minh họa các giá trị của phân tích gradient.
Nếu sử dụng chất rửa giải A, các thành phần rửa giải trước đó được tách biệt rõ ràng, nhưng các thành phần rửa giải sau đó hiển thị các đỉnh rộng hoặc có thể không rửa giải khỏi cột.
Ngược lại, nếu sử dụng chất rửa giải B, chất rửa giải trước không đủ tách biệt, trong khi chất rửa giải thứ hai cho thấy các đỉnh sắc nét.
Trong trường hợp này, phân tích gradient trong đó thành phần dung dịch rửa giải được thay đổi từ A thành B trong quá trình phân tích có thể được sử dụng để cải thiện sự phân tách theo thời gian.

Bộ phận tiêm mẫu

Một mẫu được bơm vào đường dẫn dòng chảy dung để phân tích.
Điều này được thực hiện thông qua một bộ bơm thủ công hoặc một bộ lấy mẫu tự động. Mỗi loại được trang bị van sáu cổng, để mẫu có thể được bơm vào đường dẫn dòng ở áp suất liên tục. Đối với bộ tiêm mẫu bằng tay, núm được vận hành bằng tay để đưa mẫu vào cột, như thể hiện trong Hình 3.

Núm được đặt ở vị trí “LOAD” để tiêm mẫu, như thể hiện trong hình ảnh bên trái. Sử dụng ống tiêm siêu nhỏ, mẫu có thể được bơm vào vòng mẫu, được tách ra khỏi đường dẫn dòng.
Núm vặn được chuyển sang vị trí “INJECT”. Chất rửa giải đi qua vòng lặp từ bơm sau đó đưa mẫu vào cột. Bộ lấy mẫu tự động có thể thực hiện công việc tương tự một cách tự động, cho phép hoạt động liên tục

Hình 3. Đường dẫn dòng của bộ tiêm mẫu bằng tay

Bộ phận tách

Một cột được chọn để phù hợp với cả mẫu và mục đích phân tách. Buồng sấy cột được sử dụng để duy trì nhiệt độ cột không đổi. Nếu nhiệt độ cột được phép thay đổi trong quá trình phân tích định tính hoặc định lượng, thì thời gian rửa giải của các thành phần sẽ thay đổi, do đó không thể thực hiện phân tích chính xác. Nhiệt độ phân tích thường được chọn từ 25 đến 50 ° C.

Bộ phận phát hiện

Các thành phần rửa giải từ cột được phát hiện và dữ liệu phát hiện được chuyển đổi thành tín hiệu điện. Đầu dò phải được chọn cho phù hợp với mẫu.

Bảng 1. Các loại đầu dò chính

Đầu dò điện hóa (ECD), đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), đầu dò khí dung tích điện Corona® (CAD), và các loại khác cũng được sử dụng. Ngoài ra, hệ thống LC-MS, trong đó các thành phần được phân tách bằng HPLC được phân tích thêm bằng máy quang phổ khối, đang được sử dụng rộng rãi vì độ nhạy cao và khả năng phát hiện cụ thể.

Bộ phận xử lý dữ liệu

Nồng độ của mỗi thành phần được phát hiện được tính toán từ diện tích hoặc chiều cao của pic tương ứng và được báo cáo. Mặc dù trước đây, các bộ tích hợp dễ sử dụng chủ yếu được sử dụng, các hệ thống trong đó PC thực hiện cả hoạt động của các đơn vị và phân tích kết quả gần đây đã đóng vai trò trung tâm.