Quy trình hiệu chuẩn HPLC

Quy trình hiệu chuẩn tốc độ dòng trên sắc ký lỏng

1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Đảm bảo rằng, bơm dung môi đã hoàn thành Thử nghiệm rò rỉ (Giảm áp suất).
3. Giữ ống Xả theo cách sao cho giọt pha động (Nước) rơi vào bình định mức khô, sạch 10 ml mà không chạm vào thành bình và bắt đầu ngay lập tức đồng hồ bấm giờ khi giọt đầu tiên rơi vào bình.

4. Đợi cho đến khi pha động thu được đạt đến 10 ml bình định mức và Dừng đồng hồ bấm giờ.
5. Ghi lại thời gian cần thiết để thu thập pha động 10 ml trong nhật ký hiệu chuẩn.
6. Lặp lại quy trình cho tốc độ dòng 1,0 ml, 1,5 ml và 2,0 ml / phút..
7. Lặp lại bước 3 đến 6 nhưng sử dụng loại metanol HPLC làm pha động thay vì nước.
8. So sánh kết quả về sự tuân thủ của nó với các giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
9. Nhập mục sử dụng của thiết bị và cột HPLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng thiết bị và Đăng ký nhật ký sử dụng cột tương ứng.
10. Chuẩn bị Nhãn trạng thái hiệu chuẩn và hiển thị trên thiết bị tại nơi được chỉ định.
11. Trong trường hợp không đạt tiêu chuẩn, hãy thực hiện bảo trì thiết bị.

Độ lặp lại và độ tuyến tính của thể tích tiêm mẫu
Chuẩn bị dung dịch trộn

Các bước phát triển phương pháp HPLC

1. Lấy bình định mức 50 ml sạch và khô.
2. Dùng pipet lấy 1,0 ml Benzen và Toluen cho vào bình định mức 50 ml sạch và khô.
3. Tạo thể tích đến 50 ml bằng Metanol và trộn đều.

Điều kiện sắc ký
Cột HPLC: ODS C18, (25 cm x 4,6 mm ID, 5 Laum)
Pha động: Methanol: Nước (70: 30)
Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút.
Bước sóng: 254nm
Thể tích tiêm: 20

Hiệu chuẩn

1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Đảm bảo rằng, thiết bị được đặt theo các điều kiện Sắc ký.
3. Thực hiện theo quy trình Vận hành Thiết bị, Tiêm 3 lần 10 uL và ghi lại sắc ký đồ.
4. Lặp lại việc tiêm dung dịch trên bằng cách tiêm 3 lần các thể tích 15, 20, 25, 30 uL.
5. Lấy bản in ra khỏi sắc ký đồ và đính kèm vào Nhật ký hiệu chuẩn.
6. Ghi lại diện tích và thời gian lưu của các đỉnh Benzen và Toluen trong Nhật ký hiệu chuẩn.
7. Nhập mục sử dụng của thiết bị và cột HPLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng công cụ và Đăng ký nhật ký sử dụng cột tương ứng.
8. Vẽ đường cong cho diện tích tương ứng các peak của Benzen đến đỉnh Toluene, Tìm ra RSD (độ lặp lại) và ghi lại trong Nhật ký hiệu chuẩn.
9. Tìm hiểu hệ số tương quan “r2” cho mỗi đỉnh ở năm cấp độ và ghi vào Nhật ký hiệu chuẩn.
10. So sánh kết quả với giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
11. Chuẩn bị Nhãn trạng thái hiệu chuẩn và hiển thị trên thiết bị tại nơi được chỉ định.
12. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện việc bảo trì thiết bị

Điểm kiểm tra: Kiểm tra năng lượng đèn D2 (Detector)
1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Trên cửa sổ hiển thị của Detector, một số giá trị tại các chức năng, “l(nm)”, “abs(AU)”, “range(AUFS)” and “lamp” xuất hiện.
3. Trên màn hình, giá trị cài đặt trước đó sẽ nhấp nháy tại chức năng “l(nm)”, nhập bước sóng 254nm bằng cách nhấn các phím số.
4. Nhấn phím “Func Back” và chọn các chức năng “lamp”, nhập 1 để chọn đèn D2.
5. Nhấn thêm phím “Func Back” cho đến khi “REF EN ” xuất hiện.
6. Ghi lại năng lượng tham chiếu của đèn D2 ở bước sóng 254nm trong Nhật ký hiệu chuẩn.
7 So sánh kết quả về sự tuân thủ của nó với giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
8. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện việc bảo trì thiết bị

III. Mức đáp ứng độ tuyến tính của detector
Chuẩn bị dung dịch:
1. Lấy ba bình định mức 50 ml sạch và khô.
2. Dùng pipet theo ml Benzen và Toluen theo bảng sau vào bình định mức 50 ml sạch, khô.
3. Tạo thể tích đến 50 ml bằng Metanol và trộn đều.

Điều kiện sắc ký
1. Cài đặt thiết bị theo các tham số sau theo Quy trình thiết lập tham số của thiết bị.
Cột HPLC: ODS C18, (25 cm x 4,6 mm ID, 5 m)
Pha động: Methanol: Nước (70: 30)
Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút.
Bước sóng: 254nm
Thể tích tiêm: 20 uL

Hiệu chuẩn
1. Đảm bảo rằng, thiết bị đã sẵn sàng để hiệu chuẩn và quy trình Khởi động được tuân thủ.
2. Đảm bảo rằng, thiết bị được đặt theo các điều kiện Sắc ký.
3. Thực hiện theo quy trình Vận hành Thiết bị, Tiêm từng dung dịch ba lần và ghi lại sắc ký đồ.
4. Hãy in ra của sắc ký và gắn với hiệu chuẩn vào nhật ký hiệu chuẩn
5. Ghi lại diện tích và thời gian lưu của các đỉnh Benzen và Toluene trong Nhật ký hiệu chuẩn.
6. Nhập mục sử dụng của thiết bị và cột HPLC trong Thanh ghi nhật ký sử dụng nhạc cụ và Đăng ký nhật ký sử dụng cột tương ứng.

7. Tính tỷ lệ diện tích của Benzen với Toluene, Tìm ra giá trị trung bình của các tỷ lệ và ghi lại trong Nhật ký hiệu chuẩn.
8. Tìm hiểu hệ số tương quan “r2” từ các giá trị tỷ lệ diện tích trung bình của ba cấp độ và ghi vào Nhật ký hiệu chuẩn.
8. Vẽ đường cong cho tỷ lệ diện tích tương ứng của đỉnh Benzen và Toluene với nồng độ, Tìm ra RSD (độ lặp lại) và ghi lại trong Nhật ký hiệu chuẩn.
9. So sánh kết quả về việc tuân thủ theo giới hạn được đưa ra trong Nhật ký hiệu chuẩn và đưa ra nhận xét liên quan đến Trạng thái hiệu chuẩn.
10. Chuẩn bị Nhãn trạng thái hiệu chuẩn và hiển thị trên thiết bị tại nơi được chỉ định.
11. Trong trường hợp không đạt, hãy thực hiện việc bảo trì thiết bị

HIỆU CHUẨN BƠM CỦA MÁY HPLC (Liquid Chromatography)

Calibration Status :  Satisfactory / Not Satisfactory
Next Calibration Due :
Calibrated By:                                                                                   Checked By :
Date:                                                                                                 Date:  

HIỆU CHUẨN BỘ TIÊM MẪU TỰ ĐỘNG (INJECTOR)

Model:                                            Make:
Instrument Code No.:

a. Preparation of solvent mixture :
Taken _____ ml (1.0 ml) of the ________ (Benzene) and ________ (Toluene) in to a _____ ml (50 ml) clean, dry volumetric flask, make up the volume with methanol, mixed well.

b. Chromatographic Condition :

Coefficient of co-relations : r² : _____________ (Limit : NLT : 0.999)
Calibration Status :  Satisfactory / Not Satisfactory
Next Calibration Due :
Calibrated By:                                                                                   Checked By :
Date:                                                                                                 Date :     

CALIBRATION OF DETECTOR

Mobile Phase Preparation  : Taken ______ ml of ___________ (Methanol HPLC grade) in to a _______ ml clean, dry volumetric flask, added ____________ ml of ___________(Water HPLC grade), mixed well, allowed to cool to room temperature. Filtered through 0.45/0.22 m membrane filter, degassed for _____ min. by vacuum / sonication.

Calibration Status :  Satisfactory / Not Satisfactory
Next Calibration Due :
Calibrated By :                                                                                   Checked By :
Date :                                                                                                 Date :